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細(xì)胞體外培養(yǎng)用水中水的質(zhì)量要求
提起細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)經(jīng)歷過的實(shí)驗(yàn)者都會(huì)有這樣的領(lǐng)悟吧，
細(xì)胞虐我千百遍，我待細(xì)胞如初戀。
明明小心翼翼的操作，
細(xì)胞總會(huì)莫名其妙的被污染了！
莫名其妙的掛掉啦！
到底怎么回事呢？
其實(shí)造成細(xì)胞污染的因素不單單是微生物，培養(yǎng)環(huán)境中所摻雜的物質(zhì)也可能會(huì)影響細(xì)胞的生長。水是細(xì)胞賴以生存的主要環(huán)境，營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水中，才能為細(xì)胞吸收和排泄。對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)胞來說，水是所有細(xì)胞培養(yǎng)液和試劑中簡(jiǎn)單、但也是重要的組分。所以，細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的質(zhì)量要求較高，培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞的存活和生長，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
水中的雜質(zhì)對(duì)水質(zhì)有不同影響：
1.離子——平衡滲透壓；一些重金屬 (Cadmium)對(duì)細(xì)胞毒害大，即便劑量很低 (< 0.1 ppb)；
2.微生物——污染，改變微環(huán)境如pH，影響增殖，死后釋放內(nèi)毒素等；
3.內(nèi)毒素——改變細(xì)胞外形、活化細(xì)胞、促進(jìn)或抑制細(xì)胞分裂、影響細(xì)胞附著等；
4.有機(jī)物——影響細(xì)胞的生長狀態(tài)。
水質(zhì)評(píng)價(jià)常用的指標(biāo)：
1. 電阻率（electrical resistivity）
衡量實(shí)驗(yàn)室用水導(dǎo)電性能的指標(biāo)，單位為MΩ•cm，隨著水內(nèi)無機(jī)離子的減少電阻數(shù)值逐漸變大。
2. 異體菌落數(shù)（Heterotrophic bacteria count，HBC）
衡量實(shí)驗(yàn)室用水微生物的指標(biāo)，單位為cfu/mL。
3. 有機(jī)物（Total Organic Carbon ，TOC）
水中碳的濃度，反映水中可氧化的有機(jī)化合物的含量，可間接反映出水中細(xì)菌和內(nèi)毒素含量的高低。單位為ug/L或ppb。
4. 內(nèi)毒素（Endotoxin）
革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖細(xì)胞壁碎片，又稱之為“熱原”，單位EU/mL。
參考標(biāo)準(zhǔn)化組織的實(shí)驗(yàn)室純水規(guī)范ISO3696，美國CLSI和ASTM D1193的試劑純水規(guī)范，我國GBT6682和GBT 30301的試驗(yàn)用水指導(dǎo)，《實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源的描述標(biāo)準(zhǔn)與管理規(guī)范》用水指導(dǎo)，結(jié)合多年的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出細(xì)胞培養(yǎng)用水對(duì)水質(zhì)的要求。
細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水質(zhì)的要求：
1.一定要無菌：HBC < 0.01 cfu/mL
2.無蛋白及核酸酶和內(nèi)毒素：無內(nèi)毒素或無熱源<0.03EU/mL
3.阻礙細(xì)胞生長的有機(jī)物含量要低：TOC <5 ppb
4.去除離子含量：電阻率≥18 MΩ•cm(@25℃)
細(xì)胞體外培養(yǎng)用水中純水機(jī)的配置要求
細(xì)胞培養(yǎng)過程中，各種培養(yǎng)液和試劑的配制用水均需要經(jīng)過嚴(yán)格的純化處理，不含離子和其他的雜質(zhì)，即使是儲(chǔ)存試劑的玻璃器皿，在自來水沖洗過后也應(yīng)用超純水漂洗三次以上。目前，市場(chǎng)上供應(yīng)的純水裝置種類較多，比如自來水進(jìn)水同時(shí)制備二級(jí)純水和超純水的上海樂楓Genie一體化純水裝置，可以由自來水進(jìn)水通過預(yù)處理柱P Pack、反滲透柱RO Pack及EDI（連續(xù)電流電去離子）模塊等純化后達(dá)到二級(jí)純水，儲(chǔ)存于水箱中以滿足日常的清洗應(yīng)用；水箱中的水再經(jīng)過U Pack超純化柱去離子，紫外燈照射殺菌并降低有機(jī)物含量，后經(jīng)終端濾器RephiBio過濾，以獲得無菌、無熱源、無核酸酶的超純水。
水路圖
要想達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)用水的水質(zhì)要求，純水機(jī)的配置非常關(guān)鍵，帶有消毒模塊的純水水箱、終端過濾器、取水水質(zhì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等配置都關(guān)系著產(chǎn)水水質(zhì)是否達(dá)標(biāo)。
純水的儲(chǔ)存對(duì)保持純水的質(zhì)量是至關(guān)重要的，由于周圍環(huán)境和空氣中的二氧化碳更容易使水污染改變其pH，所以儲(chǔ)存水的容器要盡量密封，避免和外界過多接觸，抑制微生物生長。如Genie純水設(shè)備可以提供的純水水箱帶有紫外消毒模塊和去除二氧化碳的過濾器，能夠大限度的保證水箱內(nèi)的純水水質(zhì)。
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| 水箱空氣過濾器（含CO2吸附劑） | 200/350L 水箱空氣過濾器 |
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| 主控屏顯示水箱水循環(huán)狀態(tài) | |
終端濾器可用于去除純水中特定類型的污染物，滿足不同實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用需求。對(duì)于細(xì)胞體外培養(yǎng)可以選用RephiBio Filter 純水終端過濾器，安裝在樂楓超純水系統(tǒng)的出水口，可有效去除水中的熱原（內(nèi)毒素）、核酸酶、細(xì)菌等雜質(zhì)，制備符合細(xì)胞培養(yǎng)用水要求的超純水（無熱原、無DNase、無RNase、無菌）。
對(duì)于超純水而言需要格外注意終端水質(zhì)的TOC、電阻率、細(xì)菌和內(nèi)毒素的含量，必須做到即取即用，因此取水的遠(yuǎn)程監(jiān)控和水質(zhì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。目前已有廠家可以提供與手柄通過無線連接的實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)（如上面提到的Genie），將水機(jī)和取水手柄分別放在潔凈間的內(nèi)外，通過無線控制取水手柄達(dá)到超純水的取用和實(shí)時(shí)檢測(cè)水的電阻率和TOC數(shù)值，非常適合無菌環(huán)境下的操作，大限度減少污染。
| 無線 · 自由 |  |
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| 手柄觸屏信息
? 系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)：待機(jī)，泄壓，循環(huán)，產(chǎn)水 ? 水箱液位：0%或者L ? 純水（超純水）水質(zhì)參數(shù)：電阻率、TOC、溫度 |
終 端 水 質(zhì) 實(shí) 時(shí) 監(jiān) 測(cè) |
結(jié)合上述用水要求，為大家推薦兩款制備超純水的水機(jī)，Genie G一體化純水儀和Genie PURIST 超純水儀。
Genie G一體化純水儀 以自來水為進(jìn)水制備超純水和 EDI 二級(jí)純水 | 性能指標(biāo)
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Genie PURIST 超純水儀 以純水（EDI 純水，RO 水或蒸餾水等）為進(jìn)水，制備實(shí)驗(yàn)室超純水。 | 性能指標(biāo)
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【注意事項(xiàng)】
1.超純水應(yīng)當(dāng)注意使用時(shí)間，應(yīng)該“即取即用”。防止超純水吸收外界的雜質(zhì)導(dǎo)致水質(zhì)下降。
2.在合適的環(huán)境使用超純水。環(huán)境中的VOC（揮發(fā)性有機(jī)物），細(xì)菌等都會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)。
3.培養(yǎng)細(xì)胞的容器應(yīng)當(dāng)潔凈無污染。
4.配制離散細(xì)胞用的消化液和細(xì)胞洗滌液時(shí)，宜采用鈣、鎂離子含量低的緩沖液，緩沖液用水可以選用裝配樂楓低鎂型純化柱的純水機(jī)，避免鈣、鎂離子促使細(xì)胞凝聚作用的產(chǎn)生。
不同細(xì)胞體外培養(yǎng)用水選擇指南
細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)的整個(gè)流程中實(shí)驗(yàn)用水貫穿每一個(gè)環(huán)節(jié)：
1.取材：組織的清洗和灌注試劑用水，如PBS緩沖液、Hanks液的配制；
2.原代培養(yǎng)：1640、DMEM等培養(yǎng)基用水，明膠等支持物的配制，添加藥物、檢測(cè)試劑的配制；
3.傳代培養(yǎng)：胰酶等消化液的配制；
4.凍存：細(xì)胞凍存液DMSO的配制。
細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞類型一般分為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)，其中難的是動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)除了需要無菌、溫度、氣體、滲透壓、pH等基本條件，它還需要血清、支持物等特殊物質(zhì)，其中原代細(xì)胞的培養(yǎng)是難的。植物細(xì)胞的培養(yǎng)需要光照和激素，而且培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術(shù)比較成熟。微生物培養(yǎng)多為單細(xì)胞生物，微生物人工培養(yǎng)的條件比動(dòng)植物細(xì)胞簡(jiǎn)單得多，蛋白胨、麥芽汁、酵母膏等天然培養(yǎng)基即可滿足微生物的營養(yǎng)要求，其中厭氧微生物培養(yǎng)比好氧微生物復(fù)雜，需要維持CO2等非氧惰性氣體的濃度。
由于細(xì)胞的種類和培養(yǎng)條件不同，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中雜質(zhì)的含量要求也不同，那么配制培養(yǎng)基或試劑用水的選擇大有講究，不同細(xì)胞體外培養(yǎng)用水的指標(biāo)如下：
細(xì)胞體外培養(yǎng)用水選擇
細(xì)胞類型 | 純水等級(jí) | 電阻率 (MΩ·cm) | TOC (ppb) | 微生物 (cfu/mL) | 內(nèi)毒素(Eu/mL） | 核酸酶 (pg/mL) |
動(dòng)物細(xì)胞 | 超純水 | >18 | <10 | <1 | <0.002 | ND |
植物細(xì)胞 | 超純水 | >18 | <10 | <1 | <0.002 | ND |
微生物 | 實(shí)驗(yàn)室Ⅱ級(jí)純水 | >10 | <50 | <1 | NA | NA |
從上表可以看出，動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的培養(yǎng)對(duì)去除內(nèi)毒素和核酸酶的要求很高，用于這兩類細(xì)胞培養(yǎng)可以選擇商品化的細(xì)胞培養(yǎng)用水，另外去除純水中的內(nèi)毒素和核酸酶可以通過在純水機(jī)的取水口安裝終端濾器達(dá)到。
各種細(xì)胞培養(yǎng)用水的比較
細(xì)胞培養(yǎng)用水 | 制備方法 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
商品化細(xì)胞培養(yǎng)用水 | 純水或超純水進(jìn)行多效蒸餾制成，嚴(yán)格控制熱源、無菌、內(nèi)毒素、pH、滲透壓等指標(biāo) | 水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)程度化高，可保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性 | 價(jià)格昂貴 |
DEPC水 | DEPC處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水，無RNase、DNAase和proteinase。 | *去除核酸酶 | 價(jià)格昂貴，未去除內(nèi)毒素 |
終端濾器過濾超純水 | 采用0.22µm的過濾膜，可有效去除水中的熱原（內(nèi)毒素）、核酸酶、細(xì)菌等雜質(zhì)。 | 性價(jià)比高，供水量大 | 對(duì)取水環(huán)境要求高 |
樂楓 RephiBio 終端過濾器采用0.22µm帶正電荷的雙層尼龍66過濾膜，可制備符合生物領(lǐng)域應(yīng)用要求的超純水（無熱原、無DNase、無RNase、無菌），純水中內(nèi)毒素含量低于0.001 Eu/mL，核酸酶的含量低于可檢測(cè)范圍，微生物的含量低于0.1 cfu/mL，可以滿足動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的需求。
Tips: 通常情況下樂楓RephiBio 終端過濾器的更換周期為3 個(gè)月，以保證使用效果。
